Δυστροφία Αμφιβληστροειδούς, Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος

Ο Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για τη Δυστροφία Αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιεί τεχνολογία αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS) για την ανάλυση 351 γονιδίων που σχετίζονται με κληρονομικές παθήσεις και εκφυλίσεις του αμφιβληστροειδούς. Πρόκειται για στοχευμένο πάνελ γονιδίων, σχεδιασμένο ώστε να υποστηρίζει την ακριβή διάγνωση, την εκτίμηση του κινδύνου και την πρόληψη.

Περισσότερες Πληροφορίες

Ο Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για τη Δυστροφία Αμφιβληστροειδούς είναι μια εκτεταμένη γενετική εξέταση που αποσκοπεί στον εντοπισμό μεταλλάξεων που σχετίζονται με ευρύ φάσμα κληρονομικών δυστροφιών του αμφιβληστροειδούς (Ιnherited Retinal Dystrophies ή IRDs), μια ομάδα εξελισσόμενων διαταραχών που χαρακτηρίζονται από εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς, οδηγώντας σε μείωση της όρασης ή τύφλωση. Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφία αμφιβληστροειδούς επιτρέπει ακριβή μοριακή διάγνωση, διευκολύνει την έγκαιρη παρέμβαση και καθοδηγεί τη διαχείριση, την πρόγνωση και τον οικογενειακό προγραμματισμό.

Οι κληρονομικές δυστροφίες του αμφιβληστροειδούς επηρεάζουν τα φωτοευαίσθητα κύτταρα και άλλες στοιβάδες του αμφιβληστροειδούς και μπορεί να εμφανιστούν ως μεμονωμένες οφθαλμικές διαταραχές ή ως μέρος πολυσυστηματικών συνδρόμων. Συχνότερες μορφές περιλαμβάνουν την μελαγχρωστική αμφιβληστροειδίτιδα (retinitis pigmentosa ή RP), την συγγενή αμαύρωση Leber (LCA), τη νόσο Stargardt, τη δυστροφία κωνίων-ραβδίων και τη χοριοειδερεμία (choroideremia). Η έναρξη μπορεί να συμβεί σε οποιαδήποτε ηλικία, από τη βρεφική έως την ενήλικη ζωή, με συμπτώματα όπως νυκταλωπία, μείωση περιφερικής ή κεντρικής όρασης ή πλήρη τύφλωση. Η βαρύτητα και η πορεία της νόσου ποικίλλουν ανάλογα με το γενετικό υπόστρωμα.

Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφία αμφιβληστροειδούς καλύπτει ευρύ φάσμα γονιδίων που εμπλέκονται στη λειτουργία, την ανάπτυξη και τη συντήρηση του αμφιβληστροειδούς, όπως RPGR, RHO, USH2A, ABCA4, CRB1, CEP290, GUCY2D, CHM, PRPH2, NR2E3 και περισσότερα από 100 άλλα γονίδια. Τα γονίδια αυτά σχετίζονται με τη φωτομεταγωγή, την μεταφορά στους κροσσούς (cilia), τη λειτουργία του μελάγχρου επιθηλίου και την επιβίωση των φωτοϋποδοχέων. Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφία αμφιβληστροειδούς ενδείκνυται σε άτομα με ανεξήγητη απώλεια όρασης, πρώιμη εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς ή οικογενειακό ιστορικό κληρονομικών δυστροφιών του αμφιβληστροειδούς (Ιnherited Retinal Dystrophies ή IRDs).

Η ανίχνευση παθογόνων μεταλλάξεων επιβεβαιώνει τη γενετική διάγνωση και βοηθά στον προσδιορισμό του τύπου της νόσου, του τρόπου κληρονόμησης και του κινδύνου επανεμφάνισης. Επηρεάζει κλινικές αποφάσεις όπως την καταλληλότητα για γονιδιακή θεραπεία ή συμμετοχή σε κλινικές δοκιμές, την ανάγκη για υποστήριξη χαμηλής όρασης ή την παρακολούθηση συνοδών εκδηλώσεων από την ακοή, τους νεφρούς ή το νευρικό σύστημα. Σε περιπτώσεις που εντοπίζονται παραλλαγές αβέβαιης σημασίας απαιτείται περαιτέρω συσχέτιση με τα κλινικά και απεικονιστικά ευρήματα. Αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη διάγνωση, καθώς δεν είναι γνωστά ή ανιχνεύσιμα όλα τα αιτιολογικά γονίδια ή μεταλλάξεις.

Αυξημένος γενετικός κίνδυνος τεκμηριώνεται όταν εντοπίζονται διπλοειδικές ή φυλοσύνδετες παθογόνες μεταλλάξεις, ιδίως σε άτομα με πρώιμη και βαριά εκδήλωση της νόσου. Μειωμένος κίνδυνος μπορεί να υποδηλώνεται όταν δεν εντοπίζονται μεταλλάξεις, αν και παραμένει υπολειπόμενος κίνδυνος λόγω τεχνικών και βιολογικών περιορισμών. Η ολοκληρωμένη διάγνωση απαιτεί τον συνδυασμό γενετικών δεδομένων με οφθαλμολογική εξέταση, ηλεκτροαμφιβληστροειδογράφημα (ERG), οπτική τομογραφία συνοχής (OCT) και οικογενειακό ιστορικό, προκειμένου να διασφαλιστεί η εξατομικευμένη φροντίδα και η πρόσβαση σε μελλοντικές θεραπευτικές επιλογές.

Η εξέταση διενεργείται σε κλινικό εργαστήριο διαπιστευμένο κατά ISO 15189 και πιστοποιημένο από CLIA και CAP, εξασφαλίζοντας την εγκυρότητα, την ακρίβεια και τη διεθνή αναγνώριση των αποτελεσμάτων.

Γονίδια και Συσχετιζόμενοι Φαινότυποι (Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για Δυστροφία Αμφιβληστροειδούς)

Ο γενετικός έλεγχος του γονιδίου πραγματοποιείται με τη λήψη ενός δείγματος αίματος ή με τη λήψη γενετικού υλικού από το εσωτερικό των παρειών (με μπατονέτα) και μπορεί να γίνει:

• Με λήψη του δείγματος στη Διαγνωστική Αθηνών. Κλείστε το ραντεβού σας σε πραγματικό χρόνο και αγοράστε την εξέταση online
• Με λήψη του δείγματος στο σπίτι. Σας στέλνουμε όλα τα απαραίτητα υλικά συλλογής στο σπίτι σας μέσω courier. Η επιστροφή του δείγματος στο εργαστήριο γίνεται επίσης μέσω courier. Αγοράστε την εξέταση online

Πλεονεκτήματα της Εξέτασης

Η εξέταση χαρακτηρίζεται από τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:

• Η πλειονότητα των περιστατικών φυλοσύνδετης μελαγχρωστικής αμφιβληστροειδίτιδας (X-linked retinitis pigmentosa ή RP) οφείλεται σε μεταλλάξεις του γονιδίου RPGR. Σημαντικό ποσοστό αυτών εντοπίζεται σε μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου, το εξώνιο ORF15 (567 αμινοξέων), το οποίο έχει την ιδιαιτερότητα ότι αποτελεί «hotspot» μεταλλάξεων και ευθύνεται για περίπου τα δύο τρίτα των παθογόνων παραλλαγών. Η περιοχή ORF15 χαρακτηρίζεται από επαναλαμβανόμενη, πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία, η οποία συνήθως παρουσιάζει μειωμένη απόδοση σε αναλύσεις με τεχνολογία NGS. Το παρόν τεστ βασίζεται σε εξειδικευμένη μέθοδο που επιτυγχάνει πλήρη κάλυψη (>20x) με υψηλή ποιότητα χαρτογράφησης (mapping quality >20) στο 100% των περιοχών-στόχων του γονιδίου RPGR. Η επικύρωση της μεθόδου έδειξε υψηλό μέσο βάθος κάλυψης (139x) για το συγκεκριμένο γονίδιο. Συνεπώς, το παρόν NGS πάνελ δεν αναμένεται να παρουσιάζει σημαντικούς περιορισμούς στην ανίχνευση παραλλαγών στο γονίδιο RPGR, συμπεριλαμβανομένου του εξονίου ORF15.
• Η ανάλυση πραγματοποιείται σε διαπιστευμένο εργαστήριο (CAP) με τη συμμετοχή πιστοποιημένου προσωπικού (CLIA) σε κλινικές εξετάσεις.
• Χρησιμοποιούνται προηγμένες τεχνολογίες αλληλούχησης, μέθοδοι εμπλουτισμού στόχου υψηλής απόδοσης και ακριβείς βιοπληροφορικές διαδικασίες, οι οποίες εξασφαλίζουν κορυφαία αναλυτική επίδοση.
• Τα περιεχόμενα των γονιδιακών πάνελ έχουν κατασκευαστεί με προσοχή ώστε να είναι κλινικά αποτελεσματικά και επιστημονικά τεκμηριωμένα.
• Σε ορισμένα γονιδιακά πανελ περιλαμβάνεται η ολική αλληλούχηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (βλ. ενότητα Γονίδια που Ελέγχονται).
• Στην κλινικού επιπέδου NGS ανάλυση περιλαμβάνονται περίπου 2.000 μη κωδικοποιητικές παθογόνες παραλλαγές (βλ. ενότητα Μη κωδικοποιητικές παραλλαγές που καλύπτονται από τον πίνακα).
• Εφαρμόζεται αυστηρό σύστημα ταξινόμησης παραλλαγών.
• Χρησιμοποιείται συστηματική ροή ερμηνείας με ιδιόκτητο λογισμικό, που επιτρέπει ακριβή και ιχνηλάσιμη επεξεργασία των δεδομένων NGS.
• Παρέχονται αναλυτικές και ολοκληρωμένες κλινικές αναφορές.

Περιορισμοί της Εξέτασης

Υπάρχουν ορισμένοι τεχνικοί και βιολογικοί περιορισμοί:

• Τα ακόλουθα εξόνια δεν περιλαμβάνονται στο πάνελ, καθώς δεν καλύπτονται επαρκώς από υψηλής ποιότητας αναγνώσεις αλληλούχισης: CHM NM_001145414.4:5, CNGA1 NM_001142564.2:2, HK1 NM_001322365.2:5, IFT81 NM_031473.4:12, KIAA0586 NM_001244189.2:6,33, NEK2 NM_001204182.2:8, PDSS1 NM_014317.5:2, RPGRIP1L NM_015272.5:23, SCLT1 NM_001300898.2:6, TCTN1 NM_001173976.2:2;NM_024549.6:6.
• Γονίδια με υποβέλτιστη κάλυψη σημειώνονται με δίεση (#), ενώ εκείνα με τμηματικούς διπλασιασμούς (μερικούς ή ολικούς) που επικαλύπτονται με περιοχές ψευδογονιδίων κατά UCSC σημειώνονται με αστερίσκο (*).
• Ένα γονίδιο θεωρείται ότι έχει υποβέλτιστη κάλυψη όταν >90% των στοχευμένων νουκλεοτιδίων δεν καλύπτονται σε >20x με δείκτη ποιότητας χαρτογράφησης (MQ>20). Στις περιπτώσεις αυτές, η ανίχνευση παραλλαγών μπορεί να είναι περιορισμένη.

Δεν ανιχνεύονται μέσω της εξέτασης:

• Πολύπλοκες αναστροφές
• Μετατροπές γονιδίων (gene conversions)
• Ισορροπημένες μεταθέσεις
• Διαταραχές επαναλήψεων (repeat expansion disorders), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά
• Μη κωδικοποιητικές παραλλαγές πέραν των ±20 ζευγών βάσεων από τα όρια εξονίων–ιντρονίων, εκτός αν έχει καθοριστεί διαφορετικά
• Ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα δεν περιλαμβάνεται σε όλα τα γονιδιακά πάνελ (βλ. Γονίδια που Ελέγχονται)

Η ανίχνευση ενδέχεται να μην είναι αξιόπιστη για:

• Χαμηλού επιπέδου μωσαϊκισμό σε πυρηνικά γονίδια (παραλλαγές με συχνότητα ελάσσονος αλληλίου ~14,6% ανιχνεύονται με πιθανότητα 90%)
• Εκτεταμένες ακολουθίες μονονουκλεοτιδικών επαναλήψεων
• Χαμηλού επιπέδου ετεροπλασμία σε mtDNA (ανιχνεύεται >90% σε επίπεδο 5%)
• Ενθέσεις/απαλοιφές >50 ζευγών βάσεων
• Διαγραφές ή διπλασιασμούς ενός εξονίου
• Παραλλαγές σε περιοχές ψευδογονιδίων ή διπλασιασμένα τμήματα του γονιδιώματος
• Παθογόνες παραλλαγές του mtDNA που δεν ανιχνεύονται στο αίμα· σε αυτές τις περιπτώσεις ενδέχεται να απαιτείται δείγμα από μετα-μιτωτικό ιστό (π.χ. σκελετικός μυς) για την επιβεβαίωση της διάγνωσης

Για πρόσθετες λεπτομέρειες, δείτε την ενότητα Βιοπληροφορική & Απόδοση.

Βιοπληροφορική

Η στοχευμένη περιοχή για κάθε γονίδιο περιλαμβάνει τα κωδικά εξόνια καθώς και ±20 ζεύγη βάσεων από τα όρια εξονίου–ιντρονίου. Επιπλέον, το πάνελ μπορεί να περιλαμβάνει μη κωδικές και ρυθμιστικές παραλλαγές, όπως αναφέρεται στην ενότητα «Μη κωδικές παραλλαγές που καλύπτονται από το πάνελ». Συγκεκριμένες περιοχές ορισμένων γονιδίων ενδέχεται να εξαιρεθούν από την ανάλυση, εφόσον αυτό αναφέρεται στην ενότητα «Περιορισμοί της εξέτασης». Όταν η εξέταση περιλαμβάνει το μιτοχονδριακό γονιδίωμα, η στοχευμένη περιοχή καλύπτει επίσης το σύνολο των μιτοχονδριακών γονιδίων.

Τα δεδομένα αλληλούχισης επεξεργάζονται μέσω ιδιόκτητου συστήματος ανάλυσης και σχολιασμού του συνεργαζόμενου διαπιστευμένου εργαστηρίου, το οποίο ενσωματώνει προηγμένους αλγορίθμους και λογισμικά. Στην πορεία της διαδικασίας έχουν ενσωματωθεί πολλαπλά στάδια ποιοτικού ελέγχου, διασφαλίζοντας την ακρίβεια, την εγκυρότητα και τη συνέπεια των αποτελεσμάτων. Η ανάλυση έχει βελτιστοποιηθεί ώστε να μεγιστοποιεί την ευαισθησία χωρίς να θυσιάζει την ειδικότητα.

Όλα τα ευρήματα συνοψίζονται σε λεπτομερή κλινική αναφορά, η οποία περιλαμβάνει δείκτες ποιότητας αλληλούχισης, πληροφορίες κάλυψης σε επίπεδο γονιδίου και επισήμανση πιθανών περιοχών με χαμηλότερη κάλυψη (<20x για τα πυρηνικά γονίδια και <1000x για το μιτοχονδριακό DNA, όπου εφαρμόζεται). Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται η διαφάνεια και υποστηρίζεται η ακριβής κλινική ερμηνεία.

Απόδοση Ανάλυσης

Τα γονίδια που περιλαμβάνονται στο πάνελ έχουν επιλεγεί προσεκτικά, με βάση επιστημονική βιβλιογραφία, βάσεις δεδομένων μεταλλάξεων και τη συσσωρευμένη κλινική εμπειρία.

Όλα τα πάνελ προέρχονται από κλινικού επιπέδου, υψηλής ποιότητας ανάλυση NGS. Αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με την ικανότητα ανίχνευσης διαφορετικών τύπων γενετικών αλλοιώσεων παρουσιάζονται στον πίνακα απόδοσης ανάλυσης και ανίχνευσης (βλ. Πίνακα).

Η εξέταση έχει επικυρωθεί για διάφορους τύπους δειγμάτων, όπως αίμα σε EDTA, απομονωμένο DNA (εκτός DNA από ιστούς ενσωματωμένους σε παραφίνη με φορμόλη), σάλιο και αποξηραμένες σταγόνες αίματος σε κάρτες. Οι συγκεκριμένοι τύποι δειγμάτων επιλέχθηκαν ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη πιθανότητα λήψης DNA υψηλής ποιότητας. Η διαγνωστική απόδοση μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τον τύπο της εξέτασης, τον θεράποντα ιατρό, το νοσοκομείο και τη χώρα. Η ανάλυση Plus που χρησιμοποιείται ενισχύει περαιτέρω την πιθανότητα γενετικής διάγνωσης, καθώς οι μεγάλες απαλοιφές και διπλασιασμοί δεν μπορούν να ανιχνευθούν αποκλειστικά μέσω αλληλούχισης. Η προσέγγιση αυτή συνδυάζει τόσο την αλληλούχιση όσο και την ανάλυση απαλοιφών/διπλασιασμών (copy number variants, CNVs).

Οι δείκτες απόδοσης που παρατίθενται παρακάτω βασίζονται σε αρχική επικύρωση που πραγματοποιήθηκε σε διαπιστευμένο κλινικό εργαστήριο, με ισοδύναμα αποτελέσματα να έχουν επιβεβαιωθεί και σε επιπλέον εργαστηριακές εγκαταστάσεις.

Απόδοση της κλινικής βαθμίδας NGS ανάλυσης, για τα πάνελ γονιδιακών ελέγχων

Δείκτες κάλυψης

Απόδοση ανάλυσης μιτοχονδριακού γονιδιώματος

Δείκτες κάλυψης μιτοχονδριακής ανάλυσης

Παρέχονται ολοκληρωμένες κλινικές αναφορές, σχεδιασμένες ώστε να προσφέρουν στους θεράποντες ιατρούς ουσιαστικές και αξιοποιήσιμες πληροφορίες. Η κλινική ερμηνεία απαιτεί στέρεη γνώση της κλινικής γενετικής και των γενετικών αρχών. Οι αναφορές συντάσσονται από ομάδες μοριακών γενετιστών, ειδικών ιατρών και άλλων έμπειρων επαγγελματιών, οι οποίοι αξιολογούν τις ταυτοποιημένες γενετικές παραλλαγές σε συνάρτηση με τα φαινοτυπικά δεδομένα που παρέχονται στο ιατρικό ιστορικό.

Στόχος είναι οι αναφορές να είναι κλινικά χρήσιμες και κατανοητές από όλους τους επαγγελματίες υγείας, ανεξάρτητα από το επίπεδο εκπαίδευσής τους στη γενετική. Κεντρικό ρόλο κατέχει η ταξινόμηση των παραλλαγών, η οποία καθορίζει την ερμηνεία και κατευθύνει τις αποφάσεις για τη διαχείριση των ασθενών. Η ταξινόμηση πραγματοποιείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες ACMG 2015. Παραλλαγές αλληλουχίας και αριθμού αντιγράφων που ταξινομούνται ως παθογόνες, πιθανώς παθογόνες ή αμφίβολης σημασίας (VUS), επιβεβαιώνονται με διπλής κατεύθυνσης αλληλούχηση Sanger ή με μεθόδους όπως qPCR/ddPCR, όταν οι ποιοτικοί δείκτες του NGS δεν επαρκούν για ένα αποτέλεσμα υψηλής αξιοπιστίας.

Σε κάθε αναφορά περιλαμβάνονται πίνακες με τις παραλλαγές στην αλληλουχία και στον αριθμό αντιγράφων, στους οποίους παρουσιάζονται βασικές πληροφορίες όπως γονιδιωματικές συντεταγμένες, ονοματολογία HGVS, ζυγωτία, συχνότητες αλληλίων, προβλέψεις in silico, φαινοτυπικές συσχετίσεις και η ταξινόμηση της παραλλαγής. Επιπλέον, παρέχονται αναλυτικές περιγραφές για την παραλλαγή, το γονίδιο και τους σχετικούς φαινότυπους, περιλαμβάνοντας τον ρόλο του γονιδίου στη νόσο, το φάσμα μεταλλάξεων, δεδομένα πληθυσμιακής συχνότητας και συσχετίσεις με παθολογικές καταστάσεις. Παρατίθενται επίσης βιβλιογραφικές αναφορές, περιλήψεις και βάσεις δεδομένων, ώστε να είναι δυνατή η περαιτέρω αξιολόγηση των ευρημάτων.

Οι αναφορές διαρθρώνονται σε δύο ενότητες: κύρια ευρήματα και πρόσθετα ευρήματα.

Κύρια ευρήματα θεωρούνται οι παραλλαγές που είναι γνωστό ότι προκαλούν νόσο ή οι σπάνιες παραλλαγές που μπορούν να εξηγήσουν τον φαινότυπο του ασθενούς. Στο συμπέρασμα συνοψίζονται όλα τα διαθέσιμα δεδομένα και παρατίθεται η τεκμηρίωση της ταξινόμησης.

Πρόσθετα ευρήματα περιλαμβάνουν παραλλαγές που, σύμφωνα με τα τρέχοντα δεδομένα, δεν επαρκούν για να εξηγήσουν τον φαινότυπο. Σε αυτά περιλαμβάνονται ετερόζυγες παραλλαγές σε γονίδια με αυτοσωμικό υπολειπόμενο πρότυπο, παραλλαγές αμφίβολης σημασίας σε αυτοσωμικά επικρατή γονίδια (όταν υπάρχει ήδη παθογόνος ή πιθανώς παθογόνος παραλλαγή που ερμηνεύει τον φαινότυπο), καθώς και αλληλόμορφα κινδύνου που ανιχνεύονται στα εξεταζόμενα γονίδια.

Η ανίχνευση παθογόνων ή πιθανώς παθογόνων παραλλαγών σε επικρατή νοσήματα ή ο συνδυασμός παραλλαγών σε αμφότερα τα αλληλόμορφα σε υπολειπόμενα νοσήματα θεωρείται μοριακή επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ο έλεγχος συγγενών μπορεί να αξιοποιηθεί για εκτίμηση του κινδύνου. Δεν συνιστάται η χρήση των παραλλαγών αμφίβολης σημασίας (VUS) για οικογενειακή εκτίμηση του κινδύνου ή για λήψη κλινικών αποφάσεων. Η γενετική συμβουλευτική κρίνεται απαραίτητη.

Αναλύονται εκατομμύρια παραλλαγές από χιλιάδες περιστατικά σπάνιων νοσημάτων, με αποτέλεσμα να εμπλουτίζεται συνεχώς η βάση δεδομένων και η κατανόηση των σχέσεων παραλλαγών–φαινοτύπου. Με την πάροδο του χρόνου, παραλλαγές που είχαν αναφερθεί σε παλαιότερες αναφορές ενδέχεται να αναταξινομηθούν. Εάν κάποια παραλλαγή που είχε δηλωθεί ως κύριο ή πρόσθετο εύρημα αλλάξει κατηγορία (π.χ. από VUS σε παθογόνο/πιθανώς παθογόνο ή αντίστροφα) εκδίδεται επικαιροποιημένη αναφορά προς τον θεράποντα ιατρό χωρίς πρόσθετη οικονομική επιβάρυνση.